Antimicrobial mechanism of epsilon-poly-L-lysine
Polyepsilon-lsyine(이하 ’PL’로 표기)은 높은 항균력으로 미생물 발효로 생산되는 천연 식품 방부제 (GRAS)로 주로 사용되며, 25~35개의 L-lysine이 일직선으로 연결된 친수성의 homo-poly-amino acid 이다. PL은 1980년대부터 일본에서 식품 방부제로 사용하기 시작했으며, 생분해가 가능해 인체내에서 독성을 일으키지 않는 것으로 알려져 있으나 식품에 많은 양을 첨가하면 쓴맛을 낼 수 있다. PL은 미생물의 membrane bound ε-PL synthetase의 polymerization반응에 의해 25~35개의 L-lysine가지가 연결되어 합성된다. PL의 항균력도 이 L-lysine 가지 개수에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 아직 정확한 항균 메커니즘은 밝혀지지 않았지만 (+)전하를 띠는 PL이 (-)를 띠는 Gram-negative 박테리아의 cell membrane 표면의 LPS가 작용을 방해하는 것으로 알려져 있다 (1, 2). 세부적인 메커니즘은 (그림 1)과 같다. (3) 그림 1의 (B)단계에서 PL (red)과 LPS (blue)의 phosphate group과 정전기적 결합으로 LPS layer가 제거되고 periplasmatic space로 진입한다. 그 후 (C)단계에서 peptidoglycan layer와 결합하거나 inner membrane으로 진입하게 된다. 이 때 PL의 농도가 높을수록 inner membrane으로 진입하는 PL의 양이 많아져 (D) 단계에서 inner membrane의 phospholipid와 결합해 negative curve를 형성한다. 그 후 (E) 단계에서 micelle 같은 형태를 형성하며 최종적으로 (F)단계에서 inner membrane의 phospholipid가 제거되어 구멍을 형성해 박테리아 세포가 손상된다. 위와 같은 메커니즘을 통해 E. coli 에 PL을 처리한 뒤 25℃에서 4시간 반응시킨 후 CLSM을 통해 관찰한 결과 화살표로 표시한 것과 같이 LPS가 돌출되는 것을 확인할 수 있다 (3) (그림 2).
Antimicrobial activity of caprylyl glyceryl ether
Caprylyl glyceryl ether의 항균 메커니즘은 밝혀지지 않았지만 비슷한 구조인 ethylhexylglycerin (EHG)이나 1,2-docecanediol의 항균 기작과 비슷할 것으로 사료된다. EHG와 1,2-dodecanediol, caprylyl glyceryl ehter의 구조는 그림 3에 비교하였다(그림 3).
1,2-dodecanediol (C12)의 Staphylococcus aureus와 Staphylococcus epidermidis에 대한 항균력을 확인한 참고 문헌에 따르면 1,2-alkanediol의 탄소 수가 증가할수록 (C12 : 1,2-dodecanediol) minimum inhibition concentration (MIC)가 낮아 높은 항균력을 나타내는 것으로 확인된다 (4) (그림 4 (A)). 또한 탄소 수가 증가할수록 Log P 는 증가하고 solubility는 감소해 물에 대한 용해도는 떨어지지만 미생물의 생장을 저해하는 효과는 증가하는 것으로 확인된다 (그림 4 (B)). 하지만 물에 대한 용해도가 너무 낮아 1,2-dodecanediol (C12)의 bactericidal effect는 확인하지 못하였다.
Octanol/water partition coefficients (log P).
반면 EHG의 E. coli에 대한 항균활성에 관한 논문에 의하면 EHG는 cell membrane을 침투해 ATP-level을 감소시켜 proton leakage를 유도하는 등 일련의 과정을 거쳐 최종적으로 ATP합성을 저해해 생장을 저해하는 메커니즘을 가지고 있다 (5). 하지만 현재까지는 대부분의 EHG가 화학적 합성을 통해 생산되고 있어 천연 방부 대체제로 사용하기에는 한계가 있다.
종합해보면 1,2-dodecanediol 항균력과 EHG의 항균 작용기작을 통해 caprylyl glyceryl ether의 높은 항균력과 작용기작을 유추할 수 있다. Caprylyl glyceryl ether는 1,2-dodecanediol에 비해 탄소수가 하나 적은 ether group으로 1,2-dodecanediol에 비해 향상된 용해도를 가지면서 EHG나 1,2-dodecanediol과 비슷한 항균활성을 가지는 우수한 화장품 방부 원료로 응용할 수 있을 것이며 EHG나 1,2-dodecanediol과 달리 천연유래 원료로 우수한 안전성을 가지며 자연 친화적인 원료로 다양한 분야에서 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
Activonol Green-PASS의 방부 효과
Activonol Green-PASS 는 자사의 천연 방부 대체제로 Caprylyl glyceryl ether, Polyepsilon-lysine, Propanediol, Water의 혼합물로 각 원료가 항균 시너지 효과를 내는 최적의 조성비로 구성되어 있다.
MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
Activonol Green-PASS의 Bacteria 3종 (그람양성균 1종, 그람음성균 2종), 효모 1종, 곰팡이 1종에 대한 MIC (Minimum Inhibitory Concentration) 결과는 다음과 같다 (표 1). Pseudomonas aeruginosa 를 제외한 모든 균주에서 0.4% 이하의 낮은 MIC 결과를 보였다. 또한 다양한 pH (pH 5~9), 다양한 온도 (실온~80℃), 다양한 보관 조건 (25~50℃, 1 month) 에서 동일한 MIC 결과를 나타내 다양한 화장품 제형이나 다양한 보관조건에서도 높은 항균력을 나타낼 수 있을 것으로 사료된다 (그림 5).
다양한 pH에 따른 MIC (A), 다양한 온도에 따른 MIC (B), 다양한 보관 조건에 따른 MIC (C)
Challenge test
Activonol Green-PASS를 구성하는 원료 중 Caprylyl glyceryl ether와 Polyepsilon-lysine을 각각 Cream (O/W type)에 적용해 Bacteria, 효모, 곰팡이에 대한 방부력 시험을 수행하였다 (PCPC 2018 Guideline). 그 결과, 두 원료를 각각 사용했을 때는 Bacteria, 효모에서는 높은 방부 효과를 보였지만 곰팡이에 대해서는 7일차 Log감소값이 각각 0.7, 0.1로 낮은 방부 효과를 나타냈다 (그림 6 (A), (B)). 반면 Activonol Green-PASS를 동일한 제형에 적용해 방부력 시험을 수행한 결과 Bacteria와 효모는 7일차 100%사멸, 곰팡이에 대해서는 7일차 Log감소값 3.2로 두 원료가 함께 작용해 높은 방부 시너지 효과를 나타냈다 (그림 6 (C)).
Caprylyl glyceryl ether (A), polyepsilon-lysine (B), Activonol Green-PASS (C).
다양한 화장품 제형에서의 방부력을 확인하기 위해 서로 다른 4가지 제형 (mask pack solution, cream (O/W type), essence solution, shampoo solution)에 Activonol Green-PASS 2.5~3% 를 처방한 뒤 bacteria, 효모, 곰팡이에 대한 방부력 시험을 수행하였다 (PCPC 2018 Guideline). 그 결과 서로 다른 4가지 제형에서 bacteria와 효모는 7일차에 100% 사멸하였고, 곰팡이에 대해서는 7일차에 90%이상 사멸하였다. 그 뒤로도 14일차, 21일차, 28일차에 계속해서 감소하는 경향을 확인하여 PCPC Guideline (2018)에 적합하였다 (그림 7).
Activonol Green-PASS의 안정성
다양한 화장품 제형에서의 안정성을 확인하기 위해 서로 다른 4가지 제형 (mask pack solution, cream (O/W type), essence solution, shampoo solution)에 Activonol Green-PASS를 3% 처방한 뒤 -20 ~ 50℃ 환경에서 30일간 외관과 pH를 확인하였다. 그 결과 Activonol Green-PASS를 처방한 다양한 제형에서 모든 온도 조건의 외관이나 pH가 안정적으로 유지되었다. 따라서 Activonol Green-PASS는 스킨케어 제품이나 헤어케어 제품의 제형에 영향을 끼치지 않는 우수한 화장품 원료로 사용될 수 있다.
Activonol Green-PASS, 100% natural 천연 방부 소재
Activonol Green-PASS는 미생물을 이용해 생산한 식품 방부대체제인 polyepsilon-lsyine, 높은 항균력을 가지는 합성 방부대체제와 비슷한 구조를 가지면서 천연 유래 물질인 caprylyl glyceryl ether, propanediol이 블랜딩된 천연 방부 소재이다. LPS와의 정전기적인 결합으로 세포막을 파괴시키는 polyepsilon-lysine과 ATP합성을 저해하는 작용 기작의 caprylyl glyceryl ether 가 서로 시너지 효과를 내는 최적의 조성비로 이뤄져 있다. 2.5~3% 농도에서 스킨케어 제품과 헤어케어 제품에 적용했을 때 높은 방부 효과를 나타내 모든 화장품 제형에 적용할 수 있는 천연 방부 대체제이다.
제품명 : Activonol Green-PASS
표시 명칭 (화장품) : 폴리엡실론-라이신, 카프릴릴글리세릴에터, 프로판디올, 정제수
INCI명 : POLYEPSIOLN-LYSINE, CAPRYLYL GLYCERYL ETHER, PROPANEDIOL, WATER
추천 농도 : 2.5~3%
Activonol Green-PASS는 COSMOS인증을 받은 천연 유래 방부 대체 원료입니다. (진행 중)
국내 특허 출원 번호 : KR20-143891
PCT 출원 번호 : (진행 중)
참고문헌
1. Yoshida T, Nagasawa T, et al. “ε-poly-L-lysine: Microbial production, biodegradation and application potential.” Applied Microbiology and Biotechnology 62 (2003):21-26
2. Yamanaka K, Maruyama C, Takagi H, Hamano Y, et al. “ε-poly-L-lysine dispersity is controlled by a highly unusual nonribosomal peptide synthetase.” Nature Chemical Biology 4 (2008):766-772
3. Hyldgaard, Morten, et al. "The antimicrobial mechanism of action of epsilon-poly-l-lysine." Applied and environmental microbiology 80.24 (2014): 7758-7770.
4. Okukawa, Minako, et al. “Antibacterial activity of 1,2-alkanediol against Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.” Journal of oleo science (2019): ess19074
5. Langsrud, Solveig, et al. “Ethylhexylglycerin impairs membrane integrity and enhances the lethal effect of phenoxyethanol.” PloSone 11.10 (2016): e0165228